Alkalická proteáza

Aplikace a princip

Tato alkalická proteáza se používá ke stanovení proteázové aktivity přípravků odvozených od Bacillus subtilis var., Vyjádřeno jako PC jednotky. a Bacillus licheniformis var. Stanovení je založeno na 30minutové proteolytické hydrolýze kaseinu při 37 ° a pH 7,0. Nehydrolyzovaný kasein se odstraní filtrací a solubilizovaný kasein se stanoví spektrofotometricky.

Činidla a roztoky alkalické proteázy
Kasein Použijte kasein Hammarsten (United States Biochemical Corp., katalogové číslo 12840 nebo ekvivalent).
Pufr Tris (pH 7,0). 12,1 g tris (hydroxymethyl) aminomethanu (nebo ekvivalentního) tris (hydroxymethyl) aminomethanu s enzymem se rozpustí v 800 ml vody a titruje se 1 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,0. Přeneste do odměrné baňky na 1000 ml, zřeďte na objem vodou a promíchejte.
Roztok TCA: V 1000 ml odměrné baňce se rozpustí 18 g kyseliny trichloroctové a 19 g trihydrátu octanu sodného v 800 ml vody, přidá se 20 ml ledové kyseliny octové, zředí se na objem vodou a promíchá se.
Roztok substrátu Rozpusťte 6,05 g tris (hydroxymethyl) aminomethanu enzymové kvality v 500 ml vody, přidejte 8 ml 1N kyseliny chlorovodíkové a promíchejte. V tomto roztoku se rozpustí 7 g kaseinu a za občasného míchání se 30 minut zahřívá ve vroucí vodní lázni.
Ochladí se na teplotu místnosti a upraví se na pH 7,0 pomocí 0,2 N kyseliny chlorovodíkové, přičemž se pomalu za intenzivního míchání přidává kyselina, aby se zabránilo vysrážení kaseinu. Směs se přenese do odměrné baňky na 1000 ml, zředí se vodou na objem a promíchá se.

Příprava vzorku Pomocí Tris pufru připravte roztok přípravku enzymového vzorku tak, aby 2 ml konečného ředění obsahovaly mezi 10 a 44 bakteriálními proteázovými jednotkami.

Postup alkalické proteázy
Pipetujte 10,0 ml roztoku substrátu do každé ze série zkumavek o rozměrech 25 x 150 mm, přičemž pro každý enzymový test ponechejte jednu zkumavku, jednu zkumavku pro každý slepý pokus s enzymem a jednu zkumavku pro slepý pokus se substrátem. Zkumavky se ekvilibrují po dobu 15 minut ve vodní lázni udržované na 37 ° ± 0,1 °.
Spusťte stopky v nulovém čase a rychle napipetujte 2,0 ml přípravku na vzorek do ekvilibrovaného substrátu. Promíchejte a vložte zkumavky do vodní lázně. Přidejte 2 ml Tris pufru (místo přípravy vzorku) do slepého pokusu se substrátem. Přesně po 30 minutách přidejte 10 ml roztoku TCA ke každé inkubaci enzymu a do slepého pokusu substrátu, aby se reakce zastavila. Zkumavky se zahřívají na vodní lázni dalších 30 minut, aby se protein úplně srážel.
Na konci druhého zahřívacího období každou zkumavku intenzivně protřepejte a přefiltrujte přes 11 cm Whatman č. 42 nebo ekvivalentní filtrační papír, přičemž první 3 ml filtrátu zlikvidujte.
[Poznámka: Filtrát musí být zcela čirý.]
Stanoví se absorbance každého filtrátu vzorku v 1 cm kyvetě při 275 nm pomocí vhodného spektrofotometru za použití filtrátu z blanku substrátu k vynulování přístroje. Opravte každé čtení odečtením příslušného slepého čtení enzymu a zaznamenejte takto získanou hodnotu jako AU.

Standardní křivkový přenos 100,0 mg L-tyrosinu, chromatograficky čistého nebo ekvivalentního (Aldrich Chemical Co.), předem vysušeného do konstantní hmotnosti, do odměrné baňky na 1000 ml. Rozpustí se v 60 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Po úplném rozpuštění zřeďte roztok na objem vodou a důkladně promíchejte. Tento roztok obsahuje 100 ug tyrosinu v 1,0 ml. Připravte další tři ředění z tohoto zásobního roztoku tak, aby obsahoval 75,0, 50,0 a 25,0 µg tyrosinu na ml. Stanoví se absorbance čtyř roztoků při 275 nm v 1 cm kyvetě na vhodném spektrofotometru proti 0,006 N kyselině chlorovodíkové. Připravte graf absorbance versus koncentrace tyrosinu.

Výpočet alkalické proteázy
Jedna bakteriální proteázová jednotka (PC) je definována jako takové množství enzymu, které produkuje ekvivalent 1,5 ug / ml L-tyrosinu za minutu za podmínek testu.
Ze standardní křivky a interpolací stanovte absorbanci roztoku s koncentrací tyrosinu 60 ug / ml. Mělo by se získat číslo blízké 0,0115. Vydělte interpolovanou hodnotu 40, abyste získali absorbanci ekvivalentní absorbanci roztoku s koncentrací tyrosinu 1,5 ug / ml, a zaznamenejte takto odvozenou hodnotu jako AS.
Vypočítejte aktivitu preparátu enzymového vzorku pomocí rovnice

PC / g = (AU / AS) × (22/30 W)

ve kterém 22 je konečný objem reakční směsi v ml; 30 je čas v minutách reakce; a W je hmotnost původního odebraného vzorku vg.

Balení a skladování alkalické proteázy

Pevný obal na balení potravin, 25 kg / barel.

Alkalická proteáza by měla být skladována na suchých, chladných a dobře větraných místech mimo dosah slunce a tepla.

Způsob platby :T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-Checking, Pay Later, LC atd.